Сегодня все чаще вместо природных белков биологи используют рекомбинантные. Что они собой представляют и какие важные задачи удается решать с их помощью ученым Казанского института биохимии и биофизики КазНЦ РАН, нашему корреспонденту рассказал заведующий лабораторией молекулярной биологии кандидат биологических наук Юрий ГОГОЛЕВ.
— Белки называют рекомбинантными, если гены, на основе которых они синтезированы, были созданы методами генной инженерии путем комбинации фрагментов ДНК из разных источников, — объясняет Юрий Викторович. — Сегодня все чаще применяют полностью “синтетические” гены, которые клонируют и копируют, помещая на какой-нибудь носитель, например бактериальную мини-хромосому — плазмиду. Эти хромосомки служат своеобразными оперативными источниками информации, которыми в природе бактерии обмениваются между собой, примерно как мы флеш-картами или оптическими дисками.
Есть универсальные носители такой информации, способные работать не только в бактериях. Важным событием стало открытие плазмид агробактерий, которыми эти патогенные микроорганизмы “инфицируют” клетки растений. В результате происходит трансформация клеток, и они, выходя из-под контроля хозяина, начинают работать на паразита. Примерно так же молекулярные биологи получают в лаборатории нужные им белковые продукты, заставляя разные клетки обслуживать рекомбинантные плазмиды.
— Такие белки можно получать только искусственным путем?
— В природе они, как правило, вырабатываются в очень ограниченных количествах, эпизодически, в небольших группах клеток. Условия для их появления не всегда известны. При этом происходит массовый синтез схожих полипептидов, которые мешают получить чистый препарат. Эти белки-спутники будут загрязнять нужное вещество, несмотря на все усилия очистить его. С рекомбинантным белком таких проблем нет. Можно сделать его основным компонентом клетки и при этом выбрать такой продуцент (обычно это бактерия), у которого нет потенциальных загрязнителей.
Кроме того, можно экспериментировать со структурой белковой молекулы: заменить какие-то аминокислотные звенья, что-то удалить или добавить. Часто к ней пришивают так называемые таги — “хвостики” из дополнительных звеньев, которые помогают “выуживать” белок из раствора, следить в микроскоп за его накоплением и движением в клетке. Примерно так же, как по штрих-коду отслеживают товар в супермаркете. Такие препараты с “хвостиком” незаменимы при некоторых биохимических и биофизических экспериментах, когда нужно быть уверенным в чистоте исследуемого вещества.
Одно из любимых занятий биофизиков — выращивание белковых кристаллов. С их помощью на рентгеновских установках получают данные о пространственном строении этих сложных молекул. И для того чтобы получить достоверную информацию, нужны чистые гомогенные белки. Другая область применения связана с изучением исчезнувших организмов. Сейчас наша молодая сотрудница кандидат биологических наук Татьяна Коннова изучает в Университете Северной Каролины (США) фермент одной вымершей рыбы. Этот фермент носит романтическое название “спящая красавица”, поскольку его удалось “оживить”, выделив из ископаемых образцов.
— Что самое важное в вашей “кухне”? Какие трудности приходится преодолевать?
— Сегодня клонировать известный ген можно без особых проблем. И даже если он не известен, его можно вычислить по соответствующему белку. Сложнее, когда нужно найти ген по предполагаемой функции кодируемого им белка. Например, в организме обнаружили какое-то физиологически активное соединение. Его биосинтез предполагает наличие фермента определенного класса. Что это за фермент? Можно попробовать рассмотреть все белки организма и найти среди них искомый. Но опять же нужно знать, где и когда искать. И хватит ли в итоге найденного белка на то, чтобы его полностью исследовать, — большой вопрос.
Другой подход — биоинформационный. Анализируется информация о белках предполагаемого класса и выявляются их общие особенности структуры, то есть обязательные сходные части белковой молекулы, так называемые консервативные домены. После этого высчитываются наиболее вероятные структуры генетического материала, непосредственно кодирующего часть белка (последовательности РНК). Синтезируется набор ДНК-зондов, улавливающих все варианты этих генетических структур. С зондами проводится несколько циклов реакций искусственного умножения ДНК с постепенно возрастающей специфичностью. Принцип подробно рассказывать не буду: реакцию сейчас выполняют во всех диагностических центрах. В результате находят гипотетический ген, вернее его центральный, самый консервативный участок.
Далее все просто. Расшифровывают нуклеотидную последовательность выявленного центрального участка и наращивают на нем недостающие концы гена. Именно наращивают благодаря замечательной способности ДНК к самовоспроизведению. Трудно поверить, но все это работает. Таким способом мы клонировали ген одного из цитохромов льна, который участвует в превращении ненасыщенных жирных кислот. В результате удалось прояснить, как в растениях происходила эволюция биосинтеза разных защитных и регуляторных соединений класса оксилипинов.
— Разве растения способны защищаться?
— Да. Одно из основных направлений исследований нашего института — изучение сигнальных систем растений. Заложено оно было академиком Игорем Анатольевичем Тарчевским и сейчас возглавляется директором института академиком Александром Николаевичем Гречкиным. Мы привыкли к тому, что растения бессловесны, нечувственны и неподвижны. Однако это не значит, что они не общаются между собой и другими организмами. Кажется само собой разумеющимся, что запах цветов привлекает опылителей — насекомых, птиц, млекопитающих. Однако мало кто задумывается, что запах зеленых листьев и плодов также играет важную роль в пищевых цепочках. Например, запах свежескошенной травы неприятен некоторым листогрызущим насекомым и копытным.
Поврежденное растение распространяет вокруг себя химический сигнал тревоги, который улавливают его “соседи” и начинают готовиться к приближающейся опасности. Они интенсивно вырабатывают горечи, вяжущие вещества и токсины, такие, как хорошо известный никотин. Поэтому животные никогда не выедают всю траву или листву на одном месте, а спешат туда, куда тревожный запах еще не распространился и зелень не только гуще, но и вкуснее.
Насекомые быстро приспосабливаются к токсинам. Однако летучие вещества, выделяемые при повреждении листьев, привлекают также хищных и паразитических насекомых, например ос-наездников. Благодаря этому хищники легче находят свою жертву и избавляют растения от вредителей. Одна такая цепочка, включающая дикорастущий табак и табачный бражник, уже стала классическим примером механизма поддержания экологического равновесия. Похожие цепочки имеются и в почвенных сообществах, где выделения пораненных корней привлекают хищных нематод.
Без преувеличения можно сказать, что сигнальными системами обладают практически все организмы. Но у растений, которые не имеют нервной системы и не могут общаться звуками, образами, танцами, особенно развита передача информации посредством химических реакций. Некоторые из них имеют до 10 сигнальных систем, образующих сложную сеть, способную координировать поведение больших групп клеток, всего организма, а иногда и целого их сообщества.
Каждая сигнальная система характеризуется набором чувствительных сенсоров на поверхности клеток. Эти миниатюрные устройства улавливают разные внешние воздействия. Полученное сообщение передается через цепочку молекулярных посредников, усиливается и влияет на механизмы, управляющие активностью генов. Отличие от гормональных систем, которые мы знаем у животных и человека, состоит в том, что в синтезе сигнального соединения способны участвовать почти все клетки организма, а не только узкоспециализированные.
Оксилипины, о которых шла речь, являются компонентом липоксигеназной сигнальной системы. Она обнаружена не только у растений, но также у морских животных, бурых, красных, сине-зеленых водорослей и некоторых бактерий. Это означает, что многие сигнальные системы очень древние. А вот физиологические задачи у них в современных условиях могут быть разными. Во всем этом мы пытаемся разобраться.
— Какие из ваших достижений наиболее значимы?
— Для академических институтов приоритетны фундаментальные исследования. Из результатов, которые кажутся нам интересными, можно отметить проведенное экспериментальное моделирование эволюции семейства ферментов цитохромов, отвечающих за три ветви метаболизма оксилипинов у растений. Были вычислены и осуществлены единичные мутации, превращающие одни ферменты в другие с изменением их каталитической активности.
Кроме того, при исследовании взаимодействия растений с микроорганизмами были описаны новые сообщества клеток бактерий — бактериальные эмболы. Это такие отдаленные аналоги многоклеточных структур в мире микроорганизмов, так же как микробные биопленки. На практике, возможно, это поможет понять причины увядания растений при некоторых заболеваниях и найти способы борьбы с ними. Возвращаясь к летучим сигнальным веществам, можно предсказать появление натуральных репеллентов, новых способов биоконтроля вредителей с использованием хищных насекомых, разработку стимуляторов фитоиммунитета. Такие препараты могут быть очень удобны для профилактики болезней растений в тепличных хозяйствах.
— Что у вас в планах?
— Прежде всего, мы расширяем круг изучаемых объектов. Кроме наземных растений нам очень интересны морские организмы. Хотелось бы заняться транскриптомными исследованиями — посмотреть, какие гены участвуют в разных сценариях растительно-микробных контактов со стороны растений и бактерий. Это касается захватывающих сюжетов информационных войн между макро- и микроорганизмами. Надеемся, что толчок в этом направлении даст освоение технологии высокопроизводительного секвенирования нового поколения. Прибор и дорогостоящие реактивы для этого уже закуплены. Достойных внимания тем много. Радует, что наши направления исследований интересны молодежи, которая в последние годы возвращается в науку. По крайней мере, в нашем институте доля молодых сотрудников увеличивается.
Беседовал
Василий ЯНЧИЛИН
Фотоснимок предоставлен Ю.Гоголевым
Нет комментариев